单克隆抗体聚合分析的通用色谱方法

方案简介

生物制药行业继续开发基于单克隆抗体（mAb）的生物治疗药物，数量越来越多。由于这些生物疗法的复杂性，需要对几个关键CQA进行测量和控制，以保证其安全性和有效性。药物制剂中聚集物的存在必须进行评估，以避免潜在的免疫原性问题。

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药品中的聚合物可能增强预期反应，但也可能导致严重的免疫原性和过敏性反应。因此，生物制药需要一种高效的分析方法，监测二聚体或多聚物的差异以控制其水平。尺寸排阻色谱法（size exclusion chromatography，SEC）无疑是一种简便和高效的聚体分析的方法。

尺寸排阻色谱法是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。又称为凝胶色谱法、分子排阻色谱法、尺寸排阻色谱法等。

凝胶过滤色谱法-GFC

一般用于分离水溶性的大分子，凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。常用的是葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖以及亲脂性凝胶。

凝胶渗透色谱法-GPC

主要用于有机溶剂中可溶的高聚物相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。

在尺寸排阻色谱柱中，各组分是根据其在流动相中流体动力学体积的差异，通过扩散进出停滞的孔而分离出来的。利用分子筛对分子大小量不同，根据各组分排阻能力的差异，完成被分离组分分离。具有中等离子强度的非变性水性缓冲液（如醋酸铵、磷酸缓冲盐溶液等），通常用于最大程度减少蛋白质与固定相表面的非特异性相互作用。

ThermoScientific™MAbPac™ SEC-1 是一款专用于分析单克隆抗体单体，聚体和片段的尺寸排阻柱子。

特点

• 键和了亲水性专利表面，能最大程度的减少色谱柱与样品之间的非尺寸排阻作用。

• 稳定的表面键合技术，低的柱流失效应可以跟 MS、ELSD 以及 CAD 检测器兼容。

• 稳定可靠的高端装填技术

• 分析单克隆抗体，聚体和片段有着超优的性能。

参数和推荐操作条件

参数	推荐操作条件
流速范围	760 – 1000 µL/min（7.8 mm 内径色谱柱） 200 – 300 µL /min（4.0 mm 内径色谱柱） 50 – 75µL /min（2.1 mm 内径色谱柱）
长期保存	20%乙腈水
五天以内	流动相保存（pH5-7）
五天以内	含有氯化钠的磷酸盐缓冲液（如50mM磷酸盐缓冲液（pH6.8）+ 0.3M氯化钠）含有氯化钠更好的缓冲液（如20mM MES缓冲液 (pH 6.1) + 0.3 M 氯化钠，甲酸铵或者乙酸铵溶液，pH5-7。
有机溶剂范围	100% 有机溶剂
温度范围	20–30 ℃
压降范围	1000 psi（300mm长度色谱柱），600 psi（150mm长度色谱柱）
pH	范围2.5 –7.5

本文通过尺寸排阻色谱分析5种重要的生物治疗性单克隆抗体(mAbs)的蛋白聚集性，结果显示Thermo Scientific™MAbPac™SEC-1色谱柱在单抗聚集性分析中的普遍适用性。

单克隆抗体聚合分析的通用色谱方法

LC运行条件：

色谱柱：MAbPac SEC-1，5µm，7.8×300 mm (P/N 088460)

流动相：0.2M氯化钠在100 mM磷酸盐缓冲液pH 6.8

流速：0.3mL/min

柱温：25℃

进样量：1µL

UV：214nm

色谱图：

曲妥珠单抗SEC分离，放大图(左)，全范围色谱图(右)。

所有5个单抗样本重叠显示相对保留时间和峰形(西妥昔单抗、英夫利昔单抗、曲妥珠单抗、利妥昔单抗、贝伐珠单抗)。

MAbPac SEC-1色谱柱是以二氧化硅为基础，具有专有的共价键合二醇亲水性层，以防止二次相互作用。选择MAbPac SEC-1色谱柱的孔径(300 Å)分析分子量为150 kDa单抗的单体和二聚体分子量范围内具有良好的分离效果。5个单抗样品建立一个通用的SEC色谱方法，结果显示峰对称；保持所需的单体和二聚体分离度。

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